Cell重磅英国学者揭示胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤（GBM）具有高侵袭性、高浸润性、瘤内及瘤间高度异质性的特点[1]，其发达的免疫逃逸机制导致至今仍未出现有效的免疫治疗方案，缺乏免疫活性GBMs动物模型也阻碍了对GBM及其免疫微环境的研究。

年4月15日，英国爱丁堡大学再生医学中心的StevenM.Pollard团队于Cell发表了「Glioblastomasacquiremyeloid-affiliatedtranscriptionalprogramsviaepigeneticimmunoeditingtoelicitimmuneevasion」一文。

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该研究中，作者通过连续将神经胶质瘤干细胞（GSCs）移植入免疫活性的宿主，揭示了GSCs细胞通过建立免疫抑制肿瘤微环境来获得免疫逃逸能力的机制：GSCs在受到免疫攻击后发生转录和表观遗传变化，降低干扰素调节因子Irf8的启动子和基因体的DNA甲基化，启动髓细胞相关转录程序来招募肿瘤相关巨噬细胞（TAM），招募而来的浸润性巨噬细胞分泌IFN-γ进一步促进Irf8的表达，从而高效增强免疫逃逸。

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研究内容

PartOne：胶质母细胞瘤细胞模型与免疫活性肿瘤鼠模型的构建

作者分离了BL6小鼠的NSCs（神经干细胞），通过分别突变五个被验证的致癌突变之一来构建GSCs：过表达EGFRvⅢ、PDGFRA，或CRISPER敲除Nf1、Pten或Trp53。

由于单突变得到的GSCs仍表达神经干细胞标志物，作者又进行了联合突变，得到NP（Nf1和Pten突变）、NPE（NP基础上过表达EGFRvII），将NP移植到免疫损伤小鼠后只得到很小的原位瘤，而NPE的移植得到了高度侵袭性的肿瘤，且检测到GBM标志物。于是作者验证了NPE在免疫活性BL6宿主中的成瘤能力（图1），成功得到用于探究GBM及其免疫微环境的免疫活性小鼠模型，同步将肿瘤植入免疫损伤NSG小鼠作为对照组。

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大多数BL6模型鼠都未出现明显的肿瘤（图1G），且BL6模型鼠的生存期显著长于NSG组（图2），这说明免疫微环境的确抑制了肿瘤形成。

PartTwo：免疫逃逸肿瘤小鼠模型的构建

作者推测能在免疫活性小鼠中形成肿瘤的细胞或许是获得了免疫逃逸能力的

肿瘤细胞，于是连续从BL6模型鼠中提取GSCs进行多次移植：首先分离得到在体外表达NSC标志物的NPE-BL6-TD（tumorderived）细胞，将其再次移植入新的BL6小鼠，分离得到成瘤性更强的NPE-IE（immuneevasion）植入新的BL6小鼠，最终得到生存期更短、成瘤性更强（图2）的小鼠模型。但若以免疫受损小鼠为宿主，NPE与NPE-IE细胞的成瘤能力相似（图2），这进一步证实了NPE-IE细胞具有免疫逃逸能力。

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PartThree：免疫逃逸机制研究

作者比较了正常鼠脑与NPE、NPE-IE肿瘤鼠脑的免疫细胞群。结果显示，后者具有更多的CD8/CD4T细胞和巨噬细胞（图3）。

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免疫组织化学染色显示，巨噬细胞主要集中在肿瘤组织而不是癌旁组织中（图4）。

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这说明具有免疫逃逸能力的NPE-IE肿瘤细胞招募了巨噬细胞。

有研究曾指出，CSF-1R(巨噬细胞克隆刺激因子-1受体)是一个潜在的胶质瘤高效治疗靶点[2]。为了探究NPE-IE的免疫逃逸是否与巨噬细胞的招募有关，作者通过靶向CSR-1R的抑制性抗体清除BL6鼠的这些巨噬细胞，结果显示，NPE-IE肿瘤显著减小甚至消失，小鼠生存期显著延长（图5），且这一清除对免疫损伤小鼠没有明显影响。

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这说明巨噬细胞的招募在BL6小鼠NPE-IE肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用，于是作者进一步探究其招募机制。

基因组和转录组的分析显示NPE-IE与NPE细胞没有太大差异，于是作者又进行了mRNA测序，发现NPE-IE细胞的许多免疫相关基因存在显著不同的转录模式（图6），尤其是之前被报道与肿瘤微环境相关的Ccl9（巨噬细胞趋化因子9）[3]。此外，Irf8（干扰素调节因子8）在免疫活性小鼠中表达显著增加，这是一个令作者惊喜的现象，因为Irf8是髓细胞特异性的转录因子，它本应只在造血细胞中表达，曾有研究表明它与巨噬细胞的分化有关[4]。这说明，受到免疫攻击后，NPE细胞能够非正常地表达一种属于髓细胞的转录因子。

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由于在小鼠模型中由免疫攻击引起的转录变化在体外培养后能够持续存在，作者猜测是发生了表观遗传变化，于是通过RRBS检测基因组甲基化水平。PCA分析结果显示，相比于NPE，NPE-IE和NPE-BL6-TD的多个DNA甲基化显著降低（图7），尤其是Irf8的启动子和基因体区域，去甲基化使其转录显著激活（图8）。

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Irf8是由巨噬细胞通过IFN-γ诱导STAT1信号通路促进分泌的，GO分析显示NPE-IE细胞的确响应于IFN-γ（图9A），因此作者假设长期暴露于IFN-γ能够刺激NPE细胞激活Irf8的表达，并在体外验证了这一假设（图9B-9C）。

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为了寻找驱动该转录变化的免疫细胞，作者从肿瘤组织中分离出免疫细胞与肿瘤细胞共培养，结果显示是巨噬细胞发挥这一作用（图10G）。随后作者敲除NPE-IE的Irf8，得到与NPE类似的侵袭性较小的肿瘤表型（图10H），进一步证明了IFN-γ诱导的Irf8是诱导NPE-IE获得免疫逃逸能力的原因。

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PartFour：临床验证

最后，作者回归临床，在人类胶质母细胞瘤中进一步验证了这一机制，证明了在人类胶质母细胞瘤中IFN-γ同样能够诱导免疫逃逸表型，且人类的具有免疫逃逸能力的胶质母细胞瘤GBMs与小鼠NPE-IE表现出相似的DNA甲基化（图11）。

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总之，本文阐述了胶质母细胞瘤的免疫逃逸与表观遗传变化之间的关系，揭示了免疫逃逸的重要调控机制，并证明了该机制在临床中的应用潜力。作者还指出，在GBM中发现的表观遗传免疫编辑过程或许在其他脑肿瘤或癌症中也发挥着重要作用，这无疑为抗肿瘤免疫的鸿图添上了极为关键的一笔。

论文链接：

[1]Aldape,K.,Brindle,K.M.,Chesler,L.,Chopra,R.,Gajjar,A.,Gilbert,M.R.,Gottardo,N.,Gutmann,D.H.,Hargrave,D.,Holland,E.C.,etal.().Challengestocuringprimarybraintumours.Nat.Rev.Clin.Oncol.16,–.

[2]Kortlever,R.M.,Sodir,N.M.,Wilson,C.H.,Burkhart,D.L.,Pellegrinet,L.,BrownSwigart,L.,Littlewood,T.D.,andEvan,G.I.().MycCooperateswithRasbyProgrammingInflammationandImmuneSuppression.Cell,–.e14.

[3]Pyonteck,S.M.,Akkari,L.,Schuhmacher,A.J.,Bowman,R.L.,Sevenich,L.,Quail,D.F.,Olson,O.C.,Quick,M.L.,Huse,J.T.,Teijeiro,V.,etal.().

[4]Tamura,T.,Nagamura-Inoue,T.,Shmeltzer,Z.,Kuwata,T.,andOzato,K.().ICSBPdirectsbipotentialmyeloidprogenitorcellstodifferentiateintomaturemacrophages.Immunity13,–.

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