缺氧诱导的EPHB2促进胶质母细胞瘤的侵

Oncotarget.

Jun14

IF:3.

Introduction

缺氧被广泛认为是促进多种癌症侵袭性的重要因素，包括胶质母细胞瘤（GBM）。临床和实验研究表明，缺氧促进GBM进展，有助于维持干细胞样细胞（胶质瘤干细胞样细胞，GSCs），并激活血管生成和血管模拟，包括GSCs向内皮细胞的转分化。GSCs被认为是GBM生长和进展的驱动力，缺氧通过诱导一组重要的基因如缺氧诱导因子（HIFs，包括HIF1α和HIF2α），间充质标记物，ZNF，CDH5等促进GSC的维持。然而，缺氧对GBM生长的意义以及缺氧诱导GBM肿瘤发生的机制尚不完全清楚。缺氧诱导蛋白2（HIG2），也称为HILPDA（缺氧诱导脂滴相关蛋白），在一些组织和癌症中被鉴定为缺氧诱导基因。HIG2是一种潜在的肾细胞癌诊断标志物，也是一种有希望的分子治疗靶点。HIG2增强WNT通路和脂质代谢活化，这两种途径对胶质瘤的发生都很重要。此外，HIG2可以通过抑制凋亡促进肿瘤细胞生长。然而，HIG2在胶质瘤中的表达模式及其生物学意义尚不完全清楚。鉴于缺氧在肿瘤发生中的重要性以及HIG2是一个特异的缺氧诱导基因，我们研究了HIG2在GBM中的表达，并评价了其意义和生物学功能。

Results

一.HIG2在胶质瘤中高表达，与肿瘤分级相关

我们首先用qPCR检测了14例Ⅱ级星形细胞瘤（A）、15例Ⅲ级间变性星形细胞瘤（AA）、31例Ⅳ级GBMs和5例正常脑组织标本中hig2mRNA的水平。与正常组织相比，II-IV级胶质瘤中的HIG2水平升高（P0.05），IV级胶质瘤中的HIG2水平高于低级别胶质瘤和正常组织（P0.05，图1A）。此外，如TCGA数据分析所示，HIG2在间充质亚型中更高表达。我们用westernblot检测了两个正常脑组织、5个A、5个AA和5个GBM样本中HIG2蛋白的水平。HIG2在胶质瘤组织中的表达一直高于正常脑组织，尤其是在GBMs中（图1B）。我们使用国家癌症研究所（NCI）的伦勃朗（分子脑肿瘤数据存储库）数据库进行多变量分析以评估影响HIG2表达的可能因素，包括诊断时的年龄、性别、肿瘤分级和KPS（Karnofsky表现状态）.我们发现肿瘤分级是与HIG2水平相关的独立因素（P0.）。这些结果表明HIG2在胶质瘤中高表达，并且随着肿瘤的分级而增加。

二.HIG2在GBM肿瘤核心和栅栏部位高表达

GBM组织中的免疫组织化学（IHC）显示坏死区和栅栏区的HIG2染色增强，在肿瘤生长过程中诱导缺氧。核心肿瘤组织和邻近的正常组织，以及坏死和非坏死组织，在病人手术中获得。qPCR和蛋白印迹分析显示肿瘤核心部分和坏死区域的HIG2水平较高（图1C-1F），与IHC结果一致，表明HIG2在缺氧条件下上调。

三.HIG2促进GBM细胞系和GSCs的增殖和侵袭

以正常NSC和星形胶质细胞系为对照，检测了HIG2在GBM细胞系中的表达，包括传统血清培养细胞系（TSCCs，包括U87、U和A）和GSC细胞系。与胶质瘤组织的结果一致，如qPCR和蛋白印迹所示，与正常NSC和星形胶质细胞相比，HIG2在TSCC和GSC细胞系中的表达更高（图2A-2C；P0.05）。然后我们用shRNA慢病毒在U87和GSC5细胞中敲除HIG2。通过qPCR（在U87和GSC5细胞中分别下调74%和81%）和蛋白印迹证实HIG2敲除。生长曲线分析显示HIG2敲除抑制U87和GSC5细胞增殖（图2D）。通过transwell侵袭试验（图2E–2F）测定，敲除也抑制了细胞侵袭，并通过AnnexinV/PI流式细胞术显示，增加了U87细胞凋亡频率。

四.缺氧和缺氧模拟上调HIG2

GSC和TSCCGBM细胞系在缺氧（1%O2）或常氧（20%O2）条件下培养24小时。缺氧使GSC和TSCC细胞系中的HIG2水平增加1.6-5.8倍（图3A-3C）。然而，HIG2在NSC细胞中没有上调，说明缺氧诱导的HIG2上调具有肿瘤特异性。此外，用缺氧模拟物去铁胺（DFO）和氯化钴（CoCl2）处理GSC和TSCC细胞也增加了HIG2水平（图3D）。缺氧或模拟缺氧诱导的HIG2上调可被缺氧诱导基因的抑制剂阻断，如棘球霉素或聚酰胺（图3E-3F）。HIG2基因敲除也抑制了缺氧条件下GBM细胞的生长和侵袭性。

五.缺氧条件下HIG2和HIFs相互上调

缺氧诱导因子（HIFs，主要包括HIF1α和HIF2α）是缺氧诱导表型效应的重要激活因子。我们检测了HIFs是否影响HIG2的表达。首先，用shRNA慢病毒在GSCs和tscc中敲除HIF1α或HIF2α。HIF1α敲除降低了TSCC和GSC细胞中的HIG2表达（图4A-4B），而HIF2α敲除降低了GSC中的HIG2表达，但未降低U87和U细胞中的HIG2表达（图4A）。这些差异效应可能是由于GSC中HIF2α的特异性表达。

HIF1α敲除也减弱了缺氧条件下GSC和TSCC细胞中HIG2的表达。HIF2α敲除持续降低GSC中HIG2表达的倍数增加，但在缺氧条件下不降低TSCC细胞。此外，HIF1α敲除抑制缺氧模拟物DFO和CoCl2诱导的HIG2上调（图4C）。

TSCC和GSCs中的HIG2敲除也降低了HIF1α的表达（图4D），并减弱了缺氧条件下HIF1α的倍数增加，表明缺氧期间HIG2和HIFs之间存在正反馈关系。

六.HIFs直接与GBM细胞中HIG2启动子相互作用作为转录因子，HIFs通过与启动子结合来调节基因表达，并被报道与假定的缺氧反应元件（HREs；RCGTG，R=A或G）结合。-/+HIG2启动子区域包含10个假定的HRE元件，包括9个单位点（HRE1，?58；HRE2，?79；HRE4，?；HRE5，?；HRE6，?；HRE7，?；HRE8，?；HRE9，?；HRE10，?）和一个头对头串联（HRE3；?/?93，图4E），提示HIFs可能直接激活HIG2的转录。我们用芯片技术研究HIFs是否直接与GBM细胞中的HIG2启动子结合。据报道，HIF1α与近端HIG2启动子结合。设计引物跨越HIG2启动子区的第1~6个HREs（HRE1~HER6，HER1-6-HIG2），用抗HIF抗体免疫沉淀后的GSC5和U87细胞核提取物进行PCR。HIF1α和HIF2α都与这些细胞中的HER1-6-HIG2区域结合（图4F）。然而，对于血清培养的U87细胞，HER1-6-HIG2区域被HIF1α结合，而不是HIF2α。这种差异可能是由于HIF2α在GSCs中的特异性表达。这些结果表明HIF1α和HIF2α通过直接结合HIG2启动子上调了GBM细胞中HIG2的表达。

七.HIG2高表达预示GBM患者预后不良

伦勃朗数据库被用来研究HIG2是否对脑胶质瘤患者有治疗作用。分析中、低、高HIG2水平胶质瘤患者的生存率。没有患者表现出超过两倍的HIG2下调，几乎一半的患者表现出超过两倍的上调。与中等水平的HIG2患者相比，HIG2表达升高的患者生存率降低（P0.，图5A）。为了排除肿瘤分级对生存率分析的影响，我们分析了GBM患者的生存率。HIG2水平与患者生存率降低相关（P0.05，图5B）。TCGA数据库分析进一步证实，在GBM患者中，HIG2mRNA升高与总生存率（P0.，图5C）和无病生存率（P=0.，图5D）呈负相关。然后我们对可能影响GBM患者生存的预后因素进行多因素Cox回归分析，包括HIG2表达、诊断年龄、性别、KPS、切除范围和替莫唑胺化疗。我们发现HIG2表达是所有胶质瘤（P0.05）和GBM患者（P0.05）生存期缩短的独立预测变量。

八.HIG2与GBM血管生成基因密切相关

我们利用ARACNe算法，基于成对基因间的信息，构建了HIG2特异性转录相互作用的全基因组列表。来自独立组的三个数据集用于确定候选HIG2相互作用基因。接下来，进行耐受性为20%的DPI以筛选可能与HIG2直接相互作用的基因（HIG2的直接相互作用基因（DIGs））。我们的分析从上述数据库中产生了三个挖掘集。所有三个挖掘组中存在的基因被认为最有可能与HIG2相互作用。这包括10个基因（按HIG2系数排序）：ADM、VEGFA、ANGPTL4、SLC39A14、PLOD2、BNIP3L、SPAG4、EGLN3、ADFP和NRN1（图6A）。值得注意的是，大多数基因参与GBM的血管生成，是很有希望的治疗靶点，尤其是VEGFA。因为针对VEGF的靶向治疗是重要的GBM治疗策略，我们探讨了HIG2和VEGFA之间的关系。

九.在GBM中HIG2和VEGF的表达与贝伐单抗耐药相关

血管生成是维持GBM肿瘤生长的重要机制，VEGFA是关键的血管生成调节因子。贝伐单抗是一种抗VEGFA的人源化单克隆抗体，是目前最有前途的GBM辅助治疗。相关分析显示GBM样本中HIG2和VEGFA水平呈正相关（P0.05，图6B–6C）。抗血管内皮生长因子治疗的耐药性一直是临床实践中的一个关键问题。由于VEGFA是HIG2-DIGs通路的关键调控因子，我们探讨了贝伐单抗对U87移植裸鼠异种移植物HIG2表达的影响。在贝伐单抗治疗的早期阶段（治疗后2周），HIG2表达下调（图6D-6E）。然而，在晚期（当小鼠出现晚期肿瘤生长的迹象和症状时；对照组小鼠约3-4周，贝伐单抗治疗组小鼠约5-7周），肿瘤进展，HIG2表达上调（图6D-6E）。这些结果表明HIG2是在抗VEGF治疗的后期诱导产生的。

Conclusion

我们的结果提示HIG2是一个很有前途的治疗GBM的新靶点，特别是对于克服贝伐单抗的耐药性。HIG2可能通过激活WNT途径或脂滴代谢发挥致瘤作用。然而，HIG2在贝伐单抗耐药性中的确切作用以及抑制HIG2的治疗效果尚需进一步研究。评价贝伐单抗联合HIG2抑制剂的治疗效果具有重要意义。进一步探讨HIG2诱导肿瘤进展的机制将为GBM提供新的治疗靶点。

Reference:HypoxiaupregulatesHIG2expressionandcontributestobevacizumabresistanceinglioblastoma

PMID:

DOI:10.18/oncotarget.

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