NEJM乳头状肾细胞癌的综合分子表征

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乳头状肾细胞癌占肾细胞癌的15～20%，是一种异质性疾病，包括具有不稳定、多灶性表现的肿瘤和具有侵袭性、高度致死性的单发肿瘤。目前对散发性乳头状肾细胞癌的遗传机制知之甚少，对晚期疾病也没有有效的治疗方式。本文中，作者采用全外显子组测序、拷贝数分析、信使RNA和microRNA测序、DNA-甲基化分析、蛋白质组分析等方法，对例原发性乳头状肾细胞癌进行了全面的分子表征。

1型和2型乳头状肾细胞癌是以特异性基因突变为特征的不同类型肾癌，2型根据与患者生存相关的分子差异进一步分为3个独立亚型。1型肿瘤与MET突变相关，而2型肿瘤的特点是CDKN2A沉默、SETD2突变、TFE3融合和NRF2-抗氧化反应元件（ARE）通路表达增加。在2型乳头状肾细胞癌的一个亚组中观察到一种CpG位点甲基化表型（CIMP），该亚组的特点是生存率低，编码富马酸水合酶（FH）的基因发生突变。

肾乳头状细胞癌有两个主要亚型：1型通常是多灶性的，其特征是乳头状和管状结构，上面覆盖着含有嗜碱性细胞质的小细胞和小的、均匀的、椭圆形的核，其与MET突变相关，而2型的特征是乳头状的，上面覆盖着含有嗜酸性细胞质的大细胞和大的、球形的、有突出核仁的核，其特点是CDKN2A沉默、SETD2突变、TFE3融合和NRF2-抗氧化反应元件（ARE）通路表达增加。

Results

组织学亚型

个肿瘤的病理审查确定了75个1型肿瘤、60个2型肿瘤和26个不能归为1型或2型的肿瘤。

Somatic的改变在1型和2型肿瘤中存在分子差异

拷贝数变化

基于单核苷酸多态性阵列的体细胞拷贝数改变，重新揭示了三个主要肿瘤亚组的独特模式。其中一个亚组主要由1型和低级别肿瘤组成，其特征为多条染色体获得（至少一条完整的染色体拷贝）（Figure1A）。另外两个亚组主要是2型肿瘤；其中一个亚组的拷贝数改变很少，另一个亚组的特点是高度的非整倍体与多条染色体丢失，包括经常丢失9p染色体，并与较差的生存时间有关(P0.)。

全外测序

全外显子组测序在个肿瘤样品中发现了10,个体细胞突变，平均每兆碱基有1.45个非沉默突变。对q值小于0.1的显著突变基因进行初步筛选，发现了5个这样的基因（MET、SETD2、NF2、KDM6A和SMARCB1），这些基因在24%的乳头状肾细胞癌中突变(Figure1B）。对PanCan21数据集中与癌症相关的基因进行分析，确定了另外6个显著突变的基因(FAT1、BAP1、PBRM1、STAG2、NFE2L2和TP53)，在36%的病例中，这些基因至少有一个发生突变(Figure1B)。

Hippo和染色质修饰途径

乳头状肾细胞癌中几个显著突变的基因是众所周知的癌症相关通路或复合物的组成部分，包括Hippo信号通路中的NF2，SWI/SNF复合物中的SMARCB1和PBRM1，以及几个修饰通路中的SETD2、KDM6A和BAP1。对这些通路中的基因评估显示，在1型和2型肿瘤中，涉及SWI/SNF复合物(分别为20%和27%,)、染色质修饰通路(分别为35%和38%)和Hippo信号通路(分别为3%和10%)的突变数量都很多(Figure1C)。

TFE3和TFEB基因融合

涉及TFE3和TFEB的基因融合先前已有报道与乳头状肾细胞癌相关。作者在17个肿瘤样品中鉴定到了基因融合（10.6%），8个涉及TFE3和TFEB基因融合。其中PRCC和SFPQ已知，RBM10和DVL2未知（Figure1D）。两种TFEB融合涉及新的融合伙伴，COL21A1和CADM2，COL21A1-TFEB融合重新导致类似于已知的MALAT1-TFEB融合的构建体，TFEB-CADM2融合导致TFEB的新型截断体，失去了几个microRNA结合位点（Figure1D）。与TFEB融合的肿瘤显示TFEB转录因子和已知的靶基因CTSK的高mRNA表达。7个涉及TFE3或TFEB的融合体在2型肿瘤中被识别（7/60）。

Figure1

肾乳头状细胞癌类型特有突变

1型肿瘤中的MET突变

作者在17个肿瘤样品中发现MET的突变。在17个MET突变中，共有14个突变发生在酪氨酸激酶域，其中13个突变发生在1型肿瘤中（占75个1型肿瘤的17%）（Figure2A,B）。此外，在8个肿瘤样品中（4个1型，3个2型和1个未分类肿瘤样品）发现了一个突变的METRNA转录本，它用一个新的外显子1拼接到规范的外显子3来取代规范的外显子1和2（Figure2A）。通过癌症中重要靶点的基因组鉴定（GISTIC2.0）分析，确定在18个乳头状肾细胞癌中观察到的1p36的丢失（11.2%）(Figure3)。1p36的缺失与7号染色体的增益和EGFR的扩增显著共存(Fishersexacttest，P=0.02)。

Figure2

Figure3

2型肿瘤中的CDKN2A突变

通过GISTIC2.0版本的分析，发现13个乳头状肾细胞癌(8.1%)中9p21的局灶性丢失，导致CDKN2A的丢失。CDKN2A的改变与2型组织学特征密切相关，25％的2型肿瘤（60个中的15个）显示突变。CDKN2A改变的肿瘤显示出磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)水平增加和细胞周期相关基因的表达量增加，这些结果与CDKN2A丢失的预测后果一致。在单变量分析中，CDKN2A改变的肿瘤患者的总生存率明显低于没有CDKN2A改变的肿瘤患者。当分析局限于2型肿瘤患者时，结果也类似(P0.)。此外，microRNAmiR-10b-5p的表达增加与其靶点CDKN2A的表达减少相关。

SETD2,BAP1,andPBRM1在2型肿瘤中突变

2型肿瘤与染色质修饰基因SETD2、BAP1和PBRM1的突变有关。BAP1和PBRM1的突变是相互排斥的，但PBRM1突变常与SETD2突变同时发生。虽然染色体3p的丢失也与2型乳头状肾细胞癌有关，但在13个SETD2、BAP1或PBRM1突变的2型肿瘤中，只有3个肿瘤出现了这种丢失，而且没有观察到启动子超甲基化。

2型肿瘤中CpG岛甲基化的表型(CIMP)

9个肿瘤（5.6％）在匹配的正常组织中未甲基化的基因座处的DNA甲基化增加。这代表了一种新的肾脏相关的CIMP，包括CDKN2A启动子的普遍超甲基化（Figure4）。9个肿瘤样品中有8个是2型乳头状肾细胞癌。在5个肿瘤样品中，作者发现FH突变（56%）。在所有9个肿瘤中，FHmRNA的表达降低，与细胞周期进展和对缺氧反应相关的基因表达增加（Figure4A）。与CIMP-相关的肿瘤患者在发病时更年轻，并且比其他乳头状肾细胞癌患者有更低的生存概率（Figure4A,B）。同样，CIMP相关的肿瘤样本显示出参与糖酵解的关键基因（HK1、LDHA和PDK1）、磷酸戊糖途径（G6PD）和脂肪酸合成（FASN）的表达增加（Figure4C）。此外，参与Krebs循环的大多数基因和脂肪酸合成的抑制剂--单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)复合物的表达量下降(Figure4D)。蛋白质G6PD、FASN和AMPK的表达数据与mRNA表达数据相关（Figure4C）。

Figure4

多平台分析识别乳头状肾细胞癌亚群

聚类分析

与拷贝数分析和DNA甲基化分析的情况一样，mRNA表达和microRNA表达的数据以及蛋白质表达的数据，将肾乳头状细胞癌的病例聚类为具有不同总体结果的独立组别。将五种数据类型结合起来进行聚类分析，确定了四个肿瘤群。C1（富含1型肿瘤），C2a和C2b（均富含2型肿瘤），和C2c（仅由CIMP相关的乳头状肾细胞癌组成）（Figure5A）。

簇C1主要是1型乳头状肾细胞癌，并与7号染色体的获得、MET突变、mRNA簇1和肿瘤发展的早期阶段(I期或II期)密切相关(Figure5A)。集群C2a主要是2型乳头状肾细胞癌，并与肿瘤发展的早期阶段和DNA甲基化簇2有关。C2b群完全由2型和未分类的乳头状肾细胞癌组成，并与DNA甲基化簇1、肿瘤发展的晚期阶段(III或IV期)和SETD2的突变有关。之前在DNA甲基化分析中观察到的CIMP相关的肿瘤亚型被保留为clusterC2c。clusterC1或clusterC2a肿瘤患者的总生存概率最高，clusterC2b肿瘤患者的概率较低，clusterC2c肿瘤患者的概率最低（Figure5B）。

Figure5

2型肿瘤中的NRF2-ARE通路

为了比较1型肿瘤和2型肿瘤的microRNA和mRNA信号，作者进行了通路富集分析，mRNA表达的数据显示NRF2-ARE通路是2型肿瘤的一个显著特征。NRF2-ARE通路激活基因NQO1的表达，在C1群中最低，在C2a和C2b群中处于中间水平，在CIMP群C2c中处于高位(P＝1×10-18)，NQO1表达的增加与生存率的降低有关(P＝0.)。这些研究结果与那些显示2型肿瘤中NRF2-ARE通路激活增加和NRF2-ARE通路基因（NFE2L2、CUL3、KEAP1和SIRT1）突变的研究结果一致.在已知激活热点中发现了4个NFE2L2（NRF2）突变，以及CUL3（5个突变）和KEAP1（1个）的突变。NFE2L2、CUL3和KEAP1中的这些突变与NQO1的高水平表达相关，但并不完全是观察到的亚型间NQO1表达差异的原因。

低频候选驱动器突变的综合分析

一些肿瘤（大多数相对较小）缺乏高置信度的候选癌症驱动事件。人工途径分析在另外27%的病例中发现了已知癌症相关基因中的候选驱动基因突变，如PTEN、NRAS、KRAS、TP53、TSC2以及MLL和ARID家族中的基因突变。虽然7号染色体的获得与乳头状细胞癌中MET表达的增加有关，但7号染色体上的其他潜在驱动基因，如EGFR，可能影响肿瘤的发生。

本文中，作者采用多组学方法来探索肾乳头状细胞癌的生物学基础，发现1型和2型乳头状肾细胞癌是截然不同的疾病类型，2型乳头状肾细胞癌是一种具有多个不同亚群的异质性疾病。不同亚型之间的共同驱动突变相对罕见。CDKN2A突变作为与2型肿瘤相关的独立预后标志物的有用性需要验证。本研究表明，涉及TFE3或TFEB的基因融合未被充分重视，在任何2型病患者中都应考虑。虽然涉及TFE3或TFEB融合的乳头状肾细胞癌一般都被认为是儿童和年轻成人的疾病，本研究中的平均年龄是52岁，作者在64岁和71岁的患者中发现有TFEB融合的肿瘤。

三个2型亚组中最明显的是由CIMP定义的亚组，其生存最差。CIMP低甲基化模式已在其他一些癌症亚型中观察到，包括胶质母细胞瘤，肺腺癌，和胃腺癌。CIMP相关的肿瘤显示出低水平的FHmRNA表达，5个有FH的种系或体细胞突变。FH的种系突变已在肾细胞癌综合征相关的侵袭性2型肿瘤中观察到，在该综合征中，由于富马酸水合酶活性的丧失而产生的高水平富马酸盐积累导致TET家族等酶的功能受损，这些酶在维持基因组水平的DNA甲基化方面发挥着作用。根据分子特征对2型肿瘤进行分组，以及存在2型肿瘤的特定子集，如那些具有TFE3融合或CIMP的肿瘤，表明根据特异性分子标记对2型乳头状肾细胞癌进行分组可能会更加精确的诊断疾病。

作者：杨国建

原文引用：DOI:10./NEJMoa

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